碱裂解法提取质粒
多数公司生产的商品化的质粒提取试剂盒多采用在碱裂解法的基础上通过特殊的吸附柱来纯化质粒DNA的方法。经碱裂解获得的含质粒的上清液和高盐的结合缓......
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(2010-12-18)
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碱裂解法利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时(酸中和)，质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K 取代Na 时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。
煮沸法利用高温破坏细菌细胞，同时利用溶菌酶酶解细菌细胞。把细菌悬浮于含有TritonX-100、溶菌酶(消化细胞壁)的缓冲液中，然后加热到100℃，使其裂解。加热破坏了细胞壁，还有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是闭环质粒DNA配对虽被破坏，但是链彼此不会分离，当温度下降恢复成超螺旋。离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，从上清液中回收质粒DNA。小量一步提取法是直接将细菌培养物和酚/氯仿混合，同时完成细胞裂解、蛋白变性两个过程，然后离心除去大部分细胞核DNA与蛋白质，含质粒DNA的上清用异丙醇沉淀。其优点是操作简单、方便、经济，特别适合大量质粒的快速分析。
多数公司生产的商品化的质粒提取试剂盒多采用在碱裂解法的基础上通过特殊的吸附柱来纯化质粒DNA的方法。经碱裂解获得的含质粒的上清液和高盐的结合缓冲液混合后，加到能高效、专一吸附DNA的特殊硅基质填充的离心吸附柱子中，再用洗涤缓冲液通过离心洗去蛋白、盐等杂质，最后用洗脱缓冲液将质粒DNA洗脱下来。在提取液中含有RNaseA，可以在提取纯化过程中除去RNA,而不用另外单独加RNaseA除去RNA,。该方法由于不用苯酚、氯仿抽提，减少了对质粒DNA破坏，而且纯度很高，超螺旋结构占80-90%。
