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二 分枝杆菌分离培养检查法
(一)培养基：分离培养基采用酸性改良罗氏培养基。
1、成分：
谷氨酸钠(纯度99%以上)
7.2
g
磷酸二氢钾(KH2PO4)
14.0
g
硫酸镁(MgSO4 7H2O)
0.24
g
柠檬酸镁
0.6
g
丙三醇
12
ml
马铃薯淀粉
蒸馏水
30
600
g
ml
新鲜全卵液
1000
ml
2%孔雀绿水溶液
20
ml
注1：无机盐试剂应采用化学纯(CP)以上等级的试剂。
注2：WHO在“结核病控制实验室工作手册(1998)”中建议分离培养使用无淀粉改良罗氏培养基。
2、制备方法：
(1) 基础液制备：量取蒸馏水600 ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴1小时使呈糊状(不时摇动，防凝块)，冷却。
(2) 新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20-30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液
(3) 将600 ml基础液和1000 ml新鲜鸡卵液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20 ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中, 每管7ml。
(4) 双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器 85℃凝固灭菌50分钟。培养基斜面应占试管的2/3。
(5) 制成的培养基应斜面鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
(6) 制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
(二)痰标本去污染处理
视标本性状，加1-2倍体积4%氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1 分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15-20分钟。样本数较多时，应分批处理。
(三)接种和培养
用吸管取去污染后的标本0.1ml, 均匀接种在整个培养基斜面，每份标本接种2只酸性罗氏培养基。接种后斜面向上于37℃环境中平放24小时后，检查培养基污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37℃继续培养。
(四)结果报告
1、 接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。培养阴性结果须在满8周后未见菌落生长者方可报告。
2、 观察时发现非分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在2-5%范围内。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。
3、培养结果报告方式：
分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长
分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的¼
分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1/2
分枝杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3/4
分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面
分枝杆菌培养阴性应以“培养阴性”报告，不得以“-”表示。菌落生长不足斜面面积¼者，报实际菌落数。
三 分枝杆菌快速培养检查
分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。由于应用营养丰富的液体培养基，并且检测仪能连续监测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。为保证检查方法的可靠性，目前分枝杆菌快速培养检查系统除提供相应仪器、试剂以外，均根据系统制定了相应的临床标本前处理方法、接种、检测和报告结果的检查规程，故在进行相应的检查时，结果的重复性和可比性均能得到认可。
在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。
四 分枝杆菌药物敏感性测定法
(一)培养基
1、基础培养基：无淀粉改良罗氏培养基
成分：
谷氨酸钠(纯度99%以上)
7.2
g
磷酸二氢钾(KH2PO4)
2.4
g
硫酸镁(MgSO4 7H2O)
0.24
g
柠檬酸镁
0.6
g
丙三醇
12
ml
蒸馏水
600
ml
新鲜全卵液
1000
ml
2%孔雀绿水溶液
20
ml
注：无机盐试剂应采用化学纯(CP)以上等级的试剂。
2、抗结核药物溶液的配制和稀释：
(1) 药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。
(2) 异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TB1)、乙硫异烟胺(TH)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重量单位计算，均为1000μg/mg，计算用药量时只需考虑其纯度。链霉素硫酸盐(SM-SO4)、乙胺丁醇盐酸盐(EMB-CL)、卡那霉素硫酸盐(KM-SO4)、卷曲霉素硫酸盐(CPM-SO4)、紫霉素硫酸盐(VM-SO4)、对氨柳酸钠盐(PAS-Na)等在考虑其纯度的同时，应按生产厂家标定的毫克效价计算其盐型用量。
(3) 每种药物按表1所示制成高浓度药液，在按相应比例稀释成低浓度药液。
(4) 除RFP、TB1、TH用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌蒸馏水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。
表1 含药培养基药物浓度及加入培养基药液浓度表
药物
培养基内药物终浓度(μg/ml)
加入培养基前药液浓度(μg/ml)
INH
1.10
100.1000
SM
10.100
2000.20000
PAS
1.10
100.1000
EMB
5.50
500.5000
RFP
50.250
5000.25000
TB1
10.100
1000.10000
TH1314
25.100
2500.10000
KM
10.100
10000.100000
CPM
10.100
10000.100000
VM
10.100
10000.100000
3、含药培养基制备：
(1) 每100 ml基础培养基加入1 ml配制、稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装7ml/管，85℃凝固50分钟。
(2) 制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
(二)绝对浓度法间接法：是我国三十多年来一直沿用的常规药敏试验方法
1、菌悬液制备：
(1) 临床分离分枝杆菌的新鲜培养物(初生长2周)无需二次传代即可做药敏试验，初生长2周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取2-3周的亚培养物进行试验。
(2) 取上述培养物(需刮取斜面各个部分的培养物)放玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以0.5%吐温-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
2、接种：将1mg/ml的菌悬液10倍稀释至10-2 mg/ml，以灭菌吸管准确吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为10-3 mg。置37℃培养四周观察结果。
3、 结果报告方式：
按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况：
分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长
分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的¼
分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1/2
分枝杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3/4
分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面
培养基斜面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
