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DNA 是生命遗传的重要物质，DNA 分子的定量分析和特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。荧光探针法较传统的同位素检测速度快，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA 自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用[1,2]。DNA 荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要因素，因而开发更灵敏的荧光探针，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研究的热点。下面对DNA 分子荧光探针的结构、功能及对DNA 的分析应用技术方面作一介绍。
1 吖啶、菲啶类
吖啶、菲啶类染料是应用最早的核酸荧光探针，它们通过嵌入或静电吸引与DNA 分子结合，使DNA 的荧光大大增强，是序列非特异的小分子探针。
吖啶的基本结构为二苯并吡啶，在水溶液中呈弱碱性。1940 年，发现当吖啶橙与酸性物质连接或存在于酸性物质中时，其特征光谱会发生一定的变化，至此一直被用于生物体的染色。吖啶橙可与DNA 或RNA 作用，与双链DNA(dsDNA)结合后的荧光激发/发射波长分别为 502/538nm(水)[3]。为提高染料稳定性及荧光强度，大量的吖啶衍生物被合成。Pavel 等[4]合成了系列硫代吖啶，并用毛细管液相色谱对其定量纯化分析。Naofumi[5]合成了10-羧甲基吖啶酯，其荧光及稳定性都有很大提高，同时含有的羧基活性基可与生物分子共价结合。Cao 等[6]在吖啶橙给体与番红T 受体之间建立了荧光共振能量转移(FRET)定量测定DNA 的方法，其中给体的最大发射波长要与受体的吸收波长重叠，对小牛胸腺DNA 的检测限为2.6×10-7mol·L-1。该法虽然灵敏度较高，但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干扰。一些吖啶的络合物，会对小沟及DNA 序列特异识别，有望成为DNA 的转录抑制剂，控制核酸的表达[7,8]。对位氨基取代的喹吖啶化合物对三链DNA 有高度的稳定作用及选择性，而且该类化合物表现出光活性，成为DNA 的光切断剂[9]。
溴乙锭是应用较广的菲啶类探针，溴乙锭可结合单链(ssDNA)、双链及多链DNA，与核酸结合后，荧光增强20～30 倍，激发波长红移30～40nm，发射波长发生蓝移，Stokes 位移较大。双嵌入剂乙锭均二聚物(Ethidium homodimer，EthD)的嵌入部分使染料分子与DNA 之间形成十分牢固的亲和力，连接常数约1011(溴乙锭仅为105)，同时对三链DNA 有高亲和作用，因而更利于应用到抗体、抗癌药物的基因水平的研究。Gherghi 等[10]用汞滴电极研究了溴乙锭、吖啶橙与dsDNA 的作用，结果显示它们的作用方式完全不同。利用488nm 氩离子激光激发和共聚焦荧光成像扫描系统对EthD 与DNA 的复合物检测，琼脂糖凝胶电泳后，检测灵敏度可达pg(10-12g) 级[11]。溴乙锭探针研究dsDNA 与树枝状大分子(Dendrimer)的相互作用[12]，对于细胞修复、分子识别等基因生命学有深远意义。富含碱基G 的ssDNA 可以形成分子内四链结构，溴乙锭的一些衍生物可以增加DNA 四链结构的稳定性并作为研究四链结构的荧光探针[13]。它们的一些光谱性质见表1[3,14,15]。
2 菁类染料
2.1 TOTO 类
吖啶橙、溴乙锭类染料虽然与核酸结合稳定，但未结合的染料自身的荧光会造成高的荧光背景，干扰检测，同时溴乙锭具有很大毒性。TOTO 和YOYO 是由Glazer 等开发的一类对dsDNA 具有高度亲和力的不对称菁染料[16,17]。染料在溶液中无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰。与dsDNA 结合后发生强烈的荧光，荧光增强约1000 倍，染料分子与DNA 的碱基对最大比例可达1/4，在琼脂糖凝胶和丙烯酰胺凝胶电泳中稳定。它们分别由单体噻唑橙TO 和噁唑黄 YO 通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二聚体。YOYO 是TOTO 的类似物，只是其中用苯并噁唑替换了苯并噻唑。改变多亚甲基链两端的染料分子，可以得到不同的异二聚体TOTAB、TOTIN 等。该类染料还有POPO、BOBO 以及不对称单亚甲基菁染料PO-PRO、BO-PRO、TO-PRO、 YO-PRO 等，共轭链碳数增加，吸收及发射波长产生红移。Rye 等认为ssDNA-TOTO 复合物稳定性及光谱性质的变化在于TOTO 头部基团与单链碱基之间的堆积作用和链上两个阳离子正电荷与DNA 骨架上的负电荷之间的库仑力共同作用的结果[18]。TOTO 可高选择性地用于dsDNA 的非序列特异性的检测，它对所有的dsDNA 表现出极高的亲和作用，但更易嵌入dsDNA 的(5'- CTAG-3')2 位，大约是100 倍的选择性，其次是(5'-CTGA-3')2 位，大约50 倍的选择性[19]。Jason 等[20]用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO 与DNA 的双嵌入作用。…………
