(2010-12-11)
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1.前夜接种受体菌(DH5α或DH10B)，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时);
2.取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm);
3.将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;
以下步骤需在超净工作台和冰上操作
4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟;
5.4℃下3000 g冷冻离心5分钟;
6.弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟;
7.4℃下3000 g冷冻离心5分钟;
8.弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮;
9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(-70℃)。
以上是基本步骤，基本同“分子克隆指南”，具体的体积(一次制作感受态细胞的量)由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。提高感受态效率的关键如下述――
4、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来;
5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，2000 g，10 min;
6、弃上清后，用预冷的水(灭菌的重蒸水)洗：先加少量水悬浮菌体(具体办法：在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮)，菌体悬浮后再把水加满，2200 g，10 min，弃上清;
7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400 g，10 min;
8、最后一次倒尽甘油后(尽量去干净)，用残存在管底的甘油悬浮细胞，每120μl分装到1.5 mL Ep管(EP管要-70度预冷)，用-70℃的乙醇迅速冰冻;
9、保存在-80℃冰箱中备用。
