钩体不易着色，一般显微镜很难观察到，必须采用黑底映光法直接查找钩体。在发病10天内可从血液及脑脊液中分离出钩体。第二周尿中可检出钩体。钩体从体液或组织中分离需要特殊的实验室技术和培养基。
最近用超速离心集菌后直接镜检法、荧光抗体染色法、原血片镀银染色法及甲苯蓝染色等方法直接检查病原体，可达到快速诊断目的，阳性贵州学习网搜集整理率在50%左右，有助于早期诊断。
动物接种是一种分离病原体的可靠方法，将患者的血液或其他体液接种于动物（幼年豚鼠和金黄地鼠）腹腔内，晚期病例可用尿液接种于动物腹部皮下。接种3～5天，用暗视野检查腹腔液，亦可在接种3～6天时取心血检查。动物接种的阳性率较高，但所需时间较长，所需费用大。
