根据结核菌感染的类型，应采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。
(一)直接涂片染色
咯痰可直接涂片。用萋～纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，因标本中可能混杂有非致病性抗性抗酸杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。如标本中结核杆菌量少，杂菌和杂质多时，直接涂片不易检出（一般需要每毫升痰液含有结核杆菌10万个以上才能检出），应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。
无菌直接采取的脑脊液、导尿或中段尿可直接用离心沉淀集菌。咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂功菌多，需用4%NaOH或3%HCL或6%H2SO4处理，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。
(二)分离培养
结核杆菌生长缓慢，培养期长，当以酸碱中和浓缩集菌的沉淀物，接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。根据生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色象菜花状，菌体染色抗酸性强，多数为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型，则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。
